Cha mẹ của Twosret vẫn còn nhiều bí ẩn. Bà có thể là một người con gái của pharaon Merneptah. Theo một số giả thuyết thì mẹ của bà là hoàng hậu tên Takhat. Takhat được sắc phong là "Vợ của Vua" và "Con gái của Vua", vì vậy bà là người hoàng tộc. Takhat có thể là con gái hoặc là cháu nội của Ramesses II; bà có lẽ đã lấy Merneptah hoặc Seti II. Hoàng hậu Takhat cũng xuất hiện trên nhiều bức tượng của Amenmesse, vì thế bà cũng được cho là mẹ của ông, nếu thế thì Twosret và Amenmesse là anh em ruột.

Twosret được nghĩ rằng đã kết hôn với pharaon Seti II và là kế hậu của ông (nếu Takhat là vợ của Seti). Không có một người con nào được biết đến giữa hai người, ngoại trừ ngôi mộ KV56 có nhắc đến một công chúa, có thể là con của 2 người[3]. Và nếu Siptah là con của Seti II, thì bà là mẹ kế của vị vua trẻ này. Bởi Siptah lên ngôi khi còn là trẻ con, bà đã làm nhiếp chính cho nhà vua.